PCR chẩn đoán P. vivax&SGA của trình tự gen P. vivax
Các mẫu phân và máu được sàng lọc bằng PCR để tìm trình tự ty thể (cox1 ) của P. vivax, dù ban đầu được thiết kế để khuếch đại trình tự P. vivax từ các mẫu đồng nhiễm với Laverania, song các mồi cũng được tìm thấy có khả năng khuếch đại mtDNA của Hepatocystis spp.Mồi Pv2768p (5′‐GTATGGATCGAATCTTACTTATTC‐3′) và Pv3287n (5′‐AATACCAGATACTAAAAGACCAACAATGATA‐3′) được dùng trong vòng PCR đầu tiên, trong khi Pv2870p (5′‐TTGCAATCATAAAACTTTAGGTC‐3′) và Pv3185n (5′‐TCCTCCAAATTCTGCTGCTGTAGATAAAATG‐3′) được dùng trong vòng thứ hai, tạo ra sản phẩm khuếch đại 297 bp. Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch bằng điện di và giải trình tự trực tiếp để xác nhận nhiễm Plasmodium spp.
Để thu được các trình tự P. vivax không có lỗi PCR gồm cả sự kết hợp sai do trùng hợp Taq gây ra và sự chuyển đổi khuôn mẫu, mẫu máu và phân từ vượn và người bị nhiễm P. vivax đã được xử lý bằng phương pháp SGA, về cơ bản như đã mô tả trong tài liệu tham khảo. DNA được chiết xuất và pha loãng điểm cuối sao cho ít hơn 30% phản ứng PCR tạo ra sản phẩm khuếch đại. Theo phân bố Poisson, một giếng tạo ra sản phẩm PCR ở độ pha loãng này sẽ chỉ chứa một khuôn mẫu có thể khuếch đại duy nhất trong hơn 83% thời gian. Nhiều vùng gen khác nhau đã được khuếch đại, gồm các đoạn ty thể S, A, B, C và D; gen clpC của apicoplast (574 bp) và các gen nhân ldh (713‐724 bp), asl (838 bp), crk 2 (666 bp) và β‐tub (684 bp).
Mồi được thiết kế trong các vùng bảo tồn của bộ gen P. vivax, ngoại trừ một bộ mồi ldh nhằm khuếch đại các KST khỉ đa dạng hơn, được thiết kế bằng cách sử dụng cả trình tự đồng thuận của P. vivax và P. knowlesi. Điều kiện chu kỳ PCR được mô tả như trong tài liệu tham khảo, ngoại trừ thời gian kéo dài khác nhau tùy thuộc vào chiều dài của đoạn khuếch đại (1 phút cho mỗi 1 kb chiều dài đoạn khuếch đại).
Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự trực tiếp và phân tích bằng phần mềm Sequencher (Gene Ann Arbor). Tất cả trình tự có đỉnh kép trong sắc ký đồ đều bị loại bỏ, ngoại trừ trình tự có nguồn gốc từ mẫu phân khỉ chứa một đỉnh kép duy nhất. Đỉnh kép đơn trong trình tự SGA cho thấy sự hiện diện của hai biến thể P. vivax khác nhau bởi một nucleotide duy nhất hoặc sự kết hợp sai PCR trong vòng PCR đầu tiên hoặc thứ hai, đã giải quyết các vị trí không rõ ràng này bằng cách chọn nucleotide giống hệt với trình tự đồng thuận P. vivax của khỉ. Cách tiếp cận thận trọng này đã tránh được việc mất đi thông tin trình tự có giá trị.
Định kiểu gen DARC
Để kiểm tra xem vượn bị nhiễm và không bị nhiễm P. vivax có biểu hiện đa hình trình tự trong vùng promoter DARC và/hoặc các trình tự mã hóa liền kề hay không, chúng tôi đã khuếch đại một vùng 1.286 bp của gen DARC trong hai đoạn PCR chồng chéo một phần từ 134 mẫu vượn (phân và máu). Đoạn A được khuếch đại bằng cách dùng DARCpF1 (5′‐GCTGTCCCATTGTCCCCTAG‐3′) và DARCpR8 (5′‐GGCCCCATACTCACCCTGTGC‐3′) trong vòng PCR đầu tiên và DARCpF3 (5′‐GCACAATGATACACAGCAAAC‐3′) và FYPdn (5′‐CCATGGCACCGTTTGGTTCAGG‐3′) trong vòng thứ hai. Đoạn B được khuếch đại bằng cách sử dụng DARC_F5 (5′‐AGGCAGTGGGCGTGGGGTAAG‐3′) và DARC_R5 (5′‐AGCCATACCAGACACAGTAGCC‐3′) trong vòng 1 và DARC_NTF1 (5′‐TTGGCTCTTATCTTGGAAGCAC‐3′) và DARC_NTR1 (5′‐TGGTGAGGATGAAGAAGGGCAGT‐3′) trong vòng thứ 2. Điều kiện PCR giống như điều kiện được sử dụng để khuếch đại mtDNA của P. vivax . Các sản phẩm khuếch đại được giải trình tự trực tiếp và phân tích bằng phần mềm Sequencher.
Đối với các địa điểm mà số lượng tinh tinh được lấy mẫu, tỷ lệ nhiễm P. vivax được ước tính dựa trên tỷ lệ cá thể dương tính (nhưng đã hiệu chỉnh theo độ nhạy của xét nghiệm; xem bên dưới), với giới hạn tin cậy 95% được xác định dựa trên giả định lấy mẫu nhị thức. Đối với các địa điểm thực địa mà số lượng cá thể được lấy mẫu chưa được biết, tỷ lệ nhiễm bệnh được ước tính dựa trên số lượng mẫu phân, nhưng đã hiệu chỉnh theo sự suy thoái mẫu vật, lấy mẫu quá mức và độ nhạy của xét nghiệm PCR chẩn đoán.
Độ nhạy của PCR chẩn đoán được ước tính bằng cách xác định tỷ lệ mẫu dương tính với PCR từ những con vượn bị nhiễm P. vivax được lấy mẫu nhiều hơn một lần trong cùng một ngày, như đã mô tả trước đây, gồm dữ liệu từ 14 con vượn (6 con tinh tinh trung tâm, 5 con tinh tinh phía đông và 3 con khỉ đột phía Tây), ước tính độ nhạy 32% (17/53 mẫu dương tính; giới hạn tin cậy được xác định dựa trên giả định lấy mẫu nhị thức). Sử dụng giá trị đã được báo cáo trước đó cho việc lấy mẫu quá mức và 1,84 lần lượt cho tinh tinh trung, khỉ đột phía tây, tinh tinh phía đông, khỉ đột phía đông và tinh tinh lùn) và sự suy giảm mẫu 10 (0,13), tỷ lệ vượn dương tính với trình tự P. vivax được ước tính cho mỗi điểm thực địa. Tuy nhiên, vì việc phát hiện P. vivax trong mẫu phân kém nhạy hơn đáng kể so với trong máu, nên tỷ lệ hiện mắc thu được nên được hiểu là ước tính tối thiểu.
Tính toán sự đa dạng nucleotide
Các trình tự P. vivax mới được tạo ra từ vượn và người đã được hiệu chỉnh với các trình tự từ bộ gen hoàn chỉnh của 5 chủng tham chiếu P. vivax (Salvador I, Ấn Độ VII, Mauritania I, Triều Tiên và Brazil I). Ngoài 5 chủng tham chiếu này, chỉ có các trình tự có nguồn gốc từ SGA mới được đưa vào phân tích, để tránh làm tăng giá trị đa dạng bằng cách bao gồm các lỗi do trùng hợp Taq gây ra. Các trình tự giống hệt nhau từ cùng một mẫu hoặc cá thể đã bị loại trừ. Các trình tự giống hệt nhau từ các mẫu hoặc cá thể khác nhau được giữ lại.
Đối với mỗi gen, các trình tự được căn chỉnh bằng ClustalW và cả hiệu chỉnh P. vivax của vượn và người đều được cắt gọn đến cùng độ dài. Sự đa dạng nucleotide ( π ) của các trình tự KST ở người và vượn được tính toán cho 6 đoạn gen P. vivax (đoạn mtDNA D, apicoplast clpC, nhân ldh, asl, crk2 và β‐tub) bằng cách dùng DnaSP phiên bản 5.10.
Tính toán khoảng cách từ P. cynomolgi&Phân tích phát sinh loài
Đối với mỗi gen P. vivax, cùng một tập hợp các trình tự được dùng để tính toán sự đa dạng đã được căn chỉnh với một trình tự tham chiếu P. cynomolgi. Khoảng cách từ mỗi trình tự P. vivax đến trình tự tham chiếu P. cynomolgi được tính toán bằng cách dùng gói R phiên bản 3.0‐8 với hiệu chỉnh Tamura‐Nei và khoảng cách trung bình được tính toán cho mỗi gen. Trình tự sắp xếp được xây dựng bằng ClustalW phiên bản 2.1 và được điều chỉnh thủ công bằng MacClade. Các vùng không thể sắp xếp rõ ràng đã bị loại bỏ khỏi các phân tích phát sinh học tiếp theo. Trình tự gen nhân được phân tích tái tổ hợp bằng GARD. Các mô hình tiến hóa cho phân tích phát sinh học được xác định bằng tiêu chí thông tin Akaike với Modeltest và PAUP. Cây phát sinh học khả năng tối đa với hỗ trợ bootstrap (100 lần lặp lại) được ước tính cùng với các giá trị tham số mô hình bằng PhyML sử dụng cả trao đổi lân cận gần nhất và hiệu chỉnhnhánh con và ghép lại với Neighbor Joining và 10 cây khởi đầu bổ sung ngẫu nhiên. Xác suất hậu nghiệm cho các nút trong cây phát sinh học được tính toán bằng MrBayes, sử dụng độ lệch chuẩn trung bình của tần số phân vùng <0,01 làm chẩn đoán hội tụ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gething, P. W. et al. A long neglected world malaria map: Plasmodium vivax endemicity in 2010. PLoS Negl. Trop. Dis. 6, e1814 (2012).
2. Mendis, K., Sina, B. J., Marchesini, P. & Carter, R. The neglected burden of Plasmodium vivax malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 97‐106 (2001).
3. Miller, L. H., Mason, S. J., Clyde, D. F. & McGinniss, M. H. The resistance factor to Plasmodium vivax in blacks. The Duffy‐blood‐group genotype, FyFy. New Engl. J. Med. 295, 302‐304 (1976).
4. Livingstone, F. B. The Duffy blood groups, vivax malaria, and malaria selection in human populations: a review. Hum. Biol. 56, 413‐425 (1984).
5. Carter, R. & Mendis, K. N. Evolutionary and historical aspects of the burden of malaria. Clin. Microbiol. Rev. 15, 564‐594 (2002).
6. Mu, J. et al. Host switch leads to emergence of Plasmodium vivax malaria in humans. Mol. Biol. Evol. 22, 1686‐1693 (2005).
7. Escalante, A. A. et al. A monkey’s tale: the origin of Plasmodium vivax as a human malaria parasite. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 1980‐1985 (2005).
8. Carlton, J. M., Das, A. & Escalante, A. A. Genomics, population genetics and evolutionary history of Plasmodium vivax. Adv. Parasitol. 81, 203‐222 (2013).
9. Tachibana, S. et al. Plasmodium cynomolgi genome sequences provide insight into Plasmodium vivax and the monkey malaria clade. Nat. Genet. 44, 1051‐1055 (2012).
10. Liu, W. et al. Origin of the human malaria parasite Plasmodium falciparum in gorillas. Nature 467, 420‐425 (2010).
11. Krief, S. et al. On the diversity of malaria parasites in African apes and the origin of Plasmodium falciparum from bonobos. PLoS Pathog. 6, e1000765 (2010).
12. Kaiser, M. et al. Wild chimpanzees infected with five Plasmodium species. Emerg. Infect. Dis. 16, 1956‐1959 (2010).
13. Prugnolle, F. et al. Diversity, host switching and evolution of Plasmodium vivax infecting African great apes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 8123‐8128 (2013).
14. Paupy, C. et al. Anopheles moucheti and Anopheles vinckei are candidate vectors of ape Plasmodium parasites, including Plasmodium praefalciparum in Gabon. PLoS One 8, e57294 (2013).
15. Duval, L. et al. African apes as reservoirs of Plasmodium falciparum and the origin and diversification of the Laverania subgenus. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 10561‐10566 (2010).
16. Santiago, M. L. et al. SIVcpz in wild chimpanzees. Science 295, 465 (2002).
17. Santiago, M. L. et al. Foci of endemic simian immunodeficiency virus infection in wild‐living eastern chimpanzees (Pan troglodytes schweinfurthii). J. Virol. 77, 7545‐7562 (2003).
18. Keele, B. F. et al. Chimpanzee reservoirs of pandemic and nonpandemic HIV‐1. Science 313, 523‐526 (2006).
19. Li, Y. et al. Eastern chimpanzees, but not bonobos, represent a simian immunodeficiency virus reservoir. J. Virol. 86, 10776‐10791 (2012).
20. Liu, W. et al. Single genome amplification and direct amplicon sequencing of Plasmodium spp. DNA from ape fecal samples. Protoc. Exch. doi:10.1038/nprot.2010.156 (2010) ).
21. Rayner, J. C., Liu, W., Peeters, M., Sharp, P. M. & Hahn, B. H. A plethora of Plasmodium species in wild apes: a source of human infection? Trends Parasitol. 27, 222‐229 (2011).
22. Tournamille, C., Colin, Y., Cartron, J. P. & Le Van Kim, C. Disruption of a GATA motif in the Duffy gene promoter abolishes erythroid gene expression in Duffy negative individuals. Nat. Genet. 10, 224‐228 (1995).
23. King, C. L. et al. Fya/Fyb antigen polymorphism in human erythrocyte Duffy antigen affects susceptibility to Plasmodium vivax malaria. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, 20113‐20118 (2011).
24. Aghokeng, A. F. et al. Extensive survey on the prevalence and genetic diversity of SIVs in primate bushmeat provides insights into risks for potential new cross‐species transmissions. Infect. Genet. Evol. 10, 386‐396 (2010).
25. Ahuka‐Mundeke, S. et al. Novel multiplexed HIV/simian immunodeficiency virus antibody detection assay. Emerg. Infect. Dis. 17, 2277‐2286 (2011).
26. Kedzierski, L. et al. Phylogenetic analysis of the genus Plasmodium based on the gene encoding adenylosuccinate lyase. Infect. Genet. Evol. 1, 297‐301 (2002).
27. Contacos, P. G. et al. Transmission of Plasmodium schwetzi from the chimpanzee to man by mosquito bite. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 190‐195 (1970).
28. Hamblin, M. T. & Di‐Rienzo, A. Detection of the signature of natural selection in humans: evidence from the Duffy blood group locus. Am. J. Hum. Genet. 66, 1669‐1679 (2000).
29. Culleton, R. & Carter, R. African Plasmodium vivax: distribution and origins. Int. J. Parasitol. 42, 1091‐1097 (2012).
30. Tanabe, K. et al. Plasmodium falciparum accompanied the human expansion out of Africa. Curr. Biol. 20, 1283‐1289 (2010).
31. Ramachandran, S. et al. Support from the relationship of genetic and geographic distance in human populations for a serial founder effect originating in Africa. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 15942‐15947 (2005).
32. Cornejo, O. E. & Escalante, A. A. The origin and age of Plasmodium vivax. Trends Parasitol. 22, 558‐563 (2006).
33. Tofanelli, S. et al. On the origins and admixture of Malagasy: new evidence from high‐resolution analyses of paternal and maternal lineages. Mol. Biol. Evol. 26, 2109‐2124 (2009).
34. Neafsey, D. E. et al. The malaria parasite Plasmodium vivax exhibits greater genetic diversity than Plasmodium falciparum. Nat. Genet. 44, 1046‐1050 (2012).
35. Mellars, P. Going east: new genetic and archaeological perspectives on the modern human colonization of Eurasia. Science 313, 796‐800 (2006).
36. Carter, R. Speculations on the origins of Plasmodium vivax malaria. Trends Parasitol. 13, 214‐219 (2003).
37. Guerra, C. A. et al. The international limits and population at risk of Plasmodium vivax transmission in 2009. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e774 (2010).
38. Culleton, R. et al. Evidence for the transmission of Plasmodium vivax in the Republic of the Congo, West Central Africa. J. Infect. Dis. 200, 1465‐‐1469 (2009).
39. Ménard, D. et al. Plasmodium vivax clinical malaria is commonly observed in Duffy‐negative Malagasy people. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 5967‐‐5971 (2010).
40. Woldearegai, T. G. et al. Plasmodium vivax malaria in Duffy‐negative individuals from Ethiopia. Trans. R Soc. Trop. Med. Hyg. 107, 328‐331 (2013).
41. Keele, B. F. et al. Increased mortality and AIDS‐like immunopathology in wild chimpanzees infected with SIVcpz. Nature 460, 515‐519 (2009).
42. Rudicell, R. S. et al. High prevalence of simian immunodeficiency virus infection in a community of savanna chimpanzees. J. Virol. 85, 9918‐9928 (2010).
43. Neel, C. et al. Molecular epidemiology of simian immunodefiociency virus infection in wild‐living gorillas. J. Virol. 84, 1464‐1476 (2009).
44. Etienne, L. et al. Non‐invasive follow‐up of simian immunodeficiency virus infection in wild‐living nonhabituated western lowland gorillas in Cameroon. J. Virol. 86, 9760‐9772 (2012).
45. Aghokeng, A. F. et al. Widely varying SIV prevalence rates in naturally infected primate species from Cameroon. Virology 345, 174‐189 (2006).
46. Sundararaman, S. A. et al. Plasmodium falciparum‐like parasites infecting wild apes in southern Cameroon do not represent a recurrent source of human malaria. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 7020‐7025 (2013).
47. Zimmerman, P. A. et al. Emergence of FY*Anull in a Plasmodium vivax‐endemic region of Papua New Guinea. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 13973‐13977 (1999).
48. Larkin, M. A. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947‐2948 (2007).
49. Librado, P. & Rozas, J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25, 1451‐1452 (2009).
50. Paradis, E., Claude, J. & Strimmer, K. APE: Analyses of Phylogenetics and Evolution in R language. Bioinformatics 20, 289‐290 (2004).
51. Tamura, K. & Nei, M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10, 512‐526 (1993).
52. Maddison, W. P. & Maddison, D. R. MacClade—Analysis of Phylogeny and Character Evolution—Version 4 Sinauer Associates, Inc. (2001).
53. Kosakovsky Pond, S. L., Posada, D., Gravenor, M. B., Woelk, C. H. & Frost, S. D. Automated phylogenetic detection of recombination using a genetic algorithm. Mol. Biol. Evol. 23, 1891‐1901 (2006).
54. Posada, D. & Buckley, T. Model selection and model averaging in phylogenetics: advantages of akaike information criterion and bayesian approaches over likelihood ratio tests. Syst. Biol. 53, 793‐808 (2004).
55. PAUP* 4.0: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods) v. 4.0b2a Sinauer Associates, Inc.: Sunderland, MA, (1999).
56. Guindon, S., Delsuc, F., Dufayard, J. F. & Gascuel, O. Estimating maximum likelihood phylogenies with PhyML. Methods Mol. Biol. 537, 113‐137 (2009).
57. Guindon, S. et al. New algorithms and methods to estimate maximum‐likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Syst. Biol. 59, 307‐321 (2010).
58. Ronquist, F. & Huelsenbeck, J. P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19, 1572‐1574 (2003).
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét‐KST‐CT Quy Nhơn
